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16S rDNA份子生态测序阐发办事

更新时候:2015-07-04 10:03:13点击次数:13729次字号:T|T
Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) 16s rDNA测序是下一代测序根本上微生物研讨范畴的操纵。其对微生物16s rDNA测序,起首获得的原始图象文件,而后颠末碱基辨认及偏差过滤,终究获得能够用于阐发的原始测序片断,咱们称之为Reads,它包含序列的碱基构成信息和其对应的序列品质信息。 可领受样本范例:口腔唾液、肠道菌群、泥土、水体等。 一、 供给DNA样品的根基请求: 1.样品纯度:OD 260/280值应...

Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) 16s rDNA测序是下一代测序根本上微生物研讨范畴的操纵。其对微生物16s rDNA测序,起首获得的原始图象文件,而后颠末碱基辨认及偏差过滤,终究获得能够用于阐发的原始测序片断,咱们称之为Reads,它包含序列的碱基构成信息和其对应的序列品质信息。


可领受样本范例:口腔唾液、肠道菌群、泥土、水体等。

一、 供给DNA样品的根基请求:

1.样品纯度:OD 260/280值应在1.7~2.0 之间;RNA 应当去除清洁。

2.样品浓度:最低浓度不低于20ng/?L。

3.样品总量:每一个样品总量不少于0.5?g。

4.样品溶剂:要消融在H20或TE(pH 8.0)中。

5.样品运输:DNA高温运输(-20℃),且在运输进程中请用parafilm将管口密封好,以防呈现净化;收到样品后,公司对样品停止检测,终究样品的量和纯度,以公司的检测成果为准。


二、数据阐发:

测序序列品质评价

操纵测序品质Q值停止评价,Q值与测序毛病E值之间干系为:


评价体例

Q值盒图统计:

盒图便是品质分位图,黄色长方形最上面的边为占25%比例的,品质Q值,依此往上别离为占50%比例,占75%比例对应的品质Q值,高低的黑线代表占90%和10%对应的品质值,蓝色的线表现品质数值的均匀值、绿色背景局部代表高品质数值局部、橘色背景局部代表公道品质数值局部、白色背景局部代表低品质数值局部。


图 quality statistics
横坐标为reads的碱基地位,纵坐标为一切reads在每一个地位上的
品质(Q: 0~40)散布。此为一个样本双端测序成果综合示例。


数据预处置

本步骤将操纵引物设想序列,以此来确当真实有用的16s rRNA 序列片断。这里咱们拔取两端皆为准确引物序列的reads 作为clean reads 停止阐发。


百般品物种分类

利用mothur(version: 1.31.2)东西的“classify.seqs()”体例对每一个样品停止物种分类判定,去除Mitochondria,Chloroplast,Eukaryota,和unknown(未在数据库中检索到)的成果。随机取样bootstrap 阈值设置为80%。

利用的数据库是RDP training set (v9),下载地点为:

拔取某一分类条理上物种分类画图。这里拔取分类为第二层:图中显现的比例指该物种分类在百般本中的序列数量占该物种分类一切序列数量的百分比。



百般品OTU及品貌和分类

利用“mothur”东西经由过程与GreenGene数据库比对,天生OTU,并计较各个OTU在每一个样品中的品貌及物种分类,去除Mitochondria,Chloroplast,Eukaryota,和unknown(未在数据库中检索到)的成果。


样品丰硕度稀少曲线

接上去利用sobs 算法对百般本停止随机抽样并计较OTU 的数量丰硕度。据此,终究绘制丰硕度(richness)稀少曲线。横坐标为抽样序列数量, 纵坐标为抽样序列中的OTU 的数量。

类似性程度为0.03 的百般本OTU 数量的稀少曲线


香农指数

计较百般本香农(shannon)指数。绘制多样性(alpha-diversity)曲线横坐标为抽样序列数量,纵坐 标为对应的香农指数。


Rank-Abundance 曲线

按照百般品的OTU 品貌和排序做Rank-Abundance 曲线。


组间韦恩图

按照以上OTU 在百般本中的分类信息绘制韦恩(venn diagram)图。穿插的局部指相邻样品配合的OTU。


群落类似度阐发

按照百般品OTU 构成和品貌的差别,计较样品间的类似度,绘制类似度树。



(编辑:sgfmt)

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